아프리카돼지열병(ASF)은 돼지에서 매우 전염성이 강하고 치명적인 출혈성 질병입니다. 최근 베트남과 필리핀에서 백신이 허가되었으나, 대규모 안전성 및 효능 검증이 충분히 이루어지지 않아 전 세계적으로 적용이 제한되고 있으며, 이에 따라 빠르고 신뢰성 있는 진단법이 효과적인 예방 및 방제에 있어 핵심적입니다. 본 연구에서는 생정보학을 통해 아프리카돼지열병 바이러스(ASFV)의 주요 구조 단백질 4종(p30, p54, p72, pA104R)에서 15개의 보존된 B-세포 에피토프를 예측 및 선별하여 다중 에피토프 항원(MEA)을 합리적으로 설계하였습니다. 재조합 MEA는 대장균에서 발현되었으며, Western blot과 간접 면역형광법을 통해 면역원성이 확인되었습니다. 이후 해당 항원을 기반으로 하는 간접 효소 면역측정법(iELISA)의 반응 조건을 체계적으로 최적화하였습니다. 100건의 ASFV 음성 혈청 시료 분석을 통해 iELISA의 최적 컷오프 값은 0.315로 결정되었습니다. 본 분석법은 우수한 재현성을 보였으며, 반복 및 검증 실험에서 변이 계수가 10% 미만이었고, 다른 주요 돼지 바이러스 항체 양성 혈청에 대해 교차 반응이 나타나지 않아 높은 특이성을 확인하였습니다. 특히, 본 iELISA는 혈청을 최대 1:6,400까지 희석해도 ASFV 항체를 검출할 수 있는 뛰어난 민감도를 보였으며, 자연감염 Genotype II 유행 지역 임상시료 검증에서 두 개 상용 ELISA 키트 대비 높은 민감도를 입증하였습니다. 본 연구 결과는 ASFV 항체 검출을 위한 민감하고 특이적인 iELISA가 성공적으로 개발되었음을 보여주며, 대규모 역학 감시와 견고한 방제전략 수립을 위한 가치 있는 신규 도구임을 제시합니다. 중요성: 아프리카돼지열병(ASF)은 전 세계적으로 막대한 경제적 손실을 유발하는 치명적인 바이러스성 돼지 질병입니다. 최근 베트남과 필리핀 등에서 백신이 허가되었으나, 전 세계적으로 표준화되고 안전한 백신의 보급에는 여전히 큰 도전이 남아 있습니다. 이에 따라, 신속하고 정확한 진단이 여전히 핵심적인 통제 수단으로 남아 있습니다. 현재 항체 기반 진단법의 한계는 민감도의 차이로 인한 미검출 사례로, 감시 프로그램의 신뢰성 저하를 야기합니다. 본 연구는 합리적인 에피토프 기반 설계 접근을 통해 이 문제를 해결하고자 하였으며, 주요 바이러스 단백질에서 15개의 보존성, 면역우성 B-세포 에피토프를 유전적으로 융합한 단일 키메라 항원을 제작하였습니다. 이를 이용한 간접 ELISA는 높은 특이성, 우수한 재현성, 무엇보다도 두 개 상용 키트 대비 뛰어난 진단 민감도를 입증하였습니다. 본 연구는 대규모 역학 감시에 신뢰도를 제공하고 ASF 방제 전략 강화를 뒷받침할 향상된 항체 진단 도구의 개발을 보고합니다.