미세주입은 유전자 편집 동물을 제작하는 데 널리 사용되는 방법이지만, 절단 후 Cas9 활성이 지속되면서 서로 다른 할구에서 편집이 일어나 모자이크 배아가 발생하는 경우가 많습니다. 본 연구에서는 근육억제 단백질(MSTN) 유전자를 타깃으로 하는 돼지 단성생식 활성화 배아에서 소분자 Cas9 억제제인 BRD0539를 CRISPR/Cas9 시스템과 함께 공동 주입하거나 배양액에 보충하는 방식이 모자이크 발생을 감소시키면서 편집 효율성에는 영향을 주지 않는지 평가했습니다. 주요 결과는 다음과 같습니다. Cas9 mRNA와 sgRNA에 10 혹은 100 μM BRD0539를 공동 주입할 경우 유전자 편집 효율성이 유의하게 감소하였습니다(각각 28.5% ± 11.6% 및 33.8% ± 4.1%, 대조군 86.9% ± 4.5%, p < 0.05). 또한, 배양액에 10 또는 50 μM BRD0539를 보충하면 편집 효율성(각각 20.8% ± 12.4% 및 47.7% ± 14.6%, 대조군 85.6% ± 4.8%)과 모자이크율(각각 25.0% ± 15.9% 및 12.5% ± 12.5%, 대조군 87.1% ± 7.8%, p < 0.05)이 모두 감소함을 확인하였습니다. 면역형광 분석 결과, 주입 후 최대 48시간까지 Cas9 단백질 발현이 지속되었습니다. 특히, 활성화 후 24~48시간 사이에 10 μM BRD0539를 단기간 배양액에 추가하면 모자이크율이 유의하게 감소(32.6% ± 7.5%, 대조군 78.7% ± 9.6%, p < 0.05)하면서 편집 효율성에는 영향이 없었습니다. 또한, 해당 처리방법은 분할율, 포배 발달, 총 세포 수에도 부정적 영향을 미치지 않았습니다. 본 연구 결과는 미세주입된 돼지 배아에서 결정적인 기간 동안 10 μM BRD0539를 일시적으로 처리하면 Cas9 활성을 효과적으로 억제해 모자이크율을 줄일 수 있음을 보여주었으며, 이는 비모자이크 유전자 편집 가축을 효율적으로 제작할 수 있는 유망한 전략임을 시사합니다.