돼지 로타바이러스(PoRV), 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV), 돼지 델타코로나바이러스(PDCoV)는 주로 돼지 설사 질병을 유발하는 주요 병원체로, 이들의 정확한 식별은 돼지 생산에서 질병 관리에 매우 중요합니다. 그러나 임상 증상이나 병리학적 발현의 중첩은 차별적인 진단에 상당한 어려움을 가져옵니다. 우리는 이 세 가지 병원체를 동시에 검출하고 구분할 수 있는 고감도 특이적 트리플렉스 RT-qPCR 분석법을 개발했습니다. 특정 프라이머와 프로브는 PoRV의 NSP5 유전자, PEDV의 S 유전자, PDCoV의 S 유전자의 보존된 영역을 기반으로 설계 및 스크리닝하였습니다. 반응 시스템은 프라이머 농도, 프로브 농도, 및 어닐링 온도를 최적화하였습니다. 이 분석은 다른 일반적인 돼지 병원체에 대한 교차 반응 없이 우수한 특이성을 보여주었고, 10 copies/µL의 감지 민감도와 동일 배치 및 배치 간 변동 계수가 1% 미만임을 확인하였습니다. 또한, 복합 샘플 내 억제 물질에 강한 내성을 나타내었습니다. 124개의 임상 샘플을 이 트리플렉스 분석법과 싱글플렉스 RT-qPCR 상업용 키트를 사용하여 병렬 시험한 결과 PoRV, PEDV, PDCoV에 대한 검출률의 완전한 일치를 보였습니다. 본 연구는 돼지 설사병 병원체의 차별적 진단을 위한 빠르고, 민감하며, 신뢰할 수 있는 강력한 트리플렉스 RT-qPCR 방법을 제공합니다.